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您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔(dān)心可能帶來的副作用？答案就是－－ＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ－Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）病毒樣顆粒疫苗。
什么是ＶＬＰｓ？
ＶＬＰｓ是由病毒單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，大多數(shù)ＶＬＰｓ的空殼結(jié)構(gòu)為二十面體或螺旋形結(jié)構(gòu)，由幾種特異的結(jié)構(gòu)蛋白組成，它們有著和真正病毒十分相似的特征，易于被免疫系統(tǒng)識別，并以與真實(shí)構(gòu)象相似的途徑呈遞病毒抗原，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但卻不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此無法復(fù)制或引發(fā)疾病［１］。簡單地說，ＶＬＰｓ疫苗提供了讓免疫系統(tǒng)＂模擬演練＂的機(jī)會，以便在遇到真正的病毒時(shí)能立即作出反應(yīng)進(jìn)行反擊，并且ＶＬＰｓ疫苗自帶佐劑效應(yīng)，相當(dāng)于＂打游戲自帶外掛＂。您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔(dān)心可能帶來的副作用？答案就是－－ＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ－Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）病毒樣顆粒疫苗。
ＶＬＰｓ作為亞單位疫苗的一種，因具有安全、高效、可實(shí)現(xiàn)鑒別診斷的突出優(yōu)勢，近年來也被認(rèn)為是最有可能替代傳統(tǒng)滅活疫苗的最佳候選疫苗形式。ＶＬＰｓ疫苗的制備過程一般包括以下步驟：病毒結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建與克隆、宿主表達(dá)系統(tǒng)選擇、分離純化、分析鑒定等［２］。
ＶＬＰｓ疫苗的分類
根據(jù)原始病毒的結(jié)構(gòu)，ＶＬＰｓ疫苗可分為有包膜和無包膜兩類。無包膜的ＶＬＰｓ疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒，一般由原核表達(dá)系統(tǒng)和低級真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細(xì)胞膜，比如Ａ型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。
圖１ 乙肝病毒示意圖
ＶＬＰｓ疫苗優(yōu)勢在哪？
１）、安全性：ＶＬＰｓ不含復(fù)制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復(fù)制能力；
２）、高效的免疫保護(hù)力：ＶＬＰｓ自組裝疫苗能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提供長期、持久的免疫保護(hù)；
３）、廣泛適應(yīng)性：ＶＬＰｓ自組裝疫苗可針對不同病原體進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括病毒、細(xì)菌等，為多種傳染病的預(yù)防和治療提供了新的選擇；
４）、表達(dá)系統(tǒng)多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和植物等多種表達(dá)體系均可用于表達(dá)ＶＬＰｓ；
５）、穩(wěn)定性和易制備性：ＶＬＰｓ疫苗具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在極端條件下保存，容易通過工程方法大規(guī)模制備，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)。
這么優(yōu)秀的疫苗，以前怎么沒聽說過？
其實(shí)不然，２０世紀(jì)８０年代以來，ＶＬＰｓ逐漸替代傳統(tǒng)疫苗成為疫苗制備的首選［３］，并且作為炎癥、疼痛、過敏、腫瘤等治療性疫苗，早已滲透在我們的生活當(dāng)中。例如乙肝疫苗、戊肝疫苗、宮頸癌疫苗和流感疫苗等都是＂現(xiàn)役＂經(jīng)典的ＶＬＰｓ疫苗，并且由默沙東開發(fā)的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ，簡稱乙肝）疫苗作為全球首個(gè)ＶＬＰｓ疫苗早在１９８６年就已獲批上市，隨后以預(yù)防人乳頭瘤病毒、戊型肝炎病毒等為適應(yīng)癥的預(yù)防疫苗相繼上市。下圖為目前上市及在研ＶＬＰｓ疫苗統(tǒng)計(jì)結(jié)果：
圖２ 上市及在研的ＶＬＰｓ疫苗
注：ＶＬＰｓ：病毒樣顆粒；ＨＰＶ：人乳頭瘤病毒；ＮＶ：諾如病毒；ＣＰ：衣殼蛋白；ＨＥＶ：戊型肝炎病毒；ｐｆｓ２５：惡性瘧原蟲表面蛋白２５；ＰｆＣＳＰ：惡孢子蛋白；Ｍ２ｅ：基質(zhì)蛋白２胞外結(jié)構(gòu)域；ＨＡ：血凝素；ＮＡ：神經(jīng)氨酸酶；Ｅ：包膜蛋白；ｇｐ４１：糖蛋白４１；－：未命名
ＶＬＰｓ疫苗的表達(dá)系統(tǒng)
ＶＬＰｓ常用表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、桿狀病毒／昆蟲細(xì)胞、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞、無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，約有１７０種不同的宿主表達(dá)系統(tǒng)可用，目前已報(bào)導(dǎo)的ＶＬＰｓ疫苗約７０％基于真核表達(dá)系統(tǒng)，３０％基于原核表達(dá)系統(tǒng)，并且已有１００余種ＶＬＰｓ被制備及鑒定。不同表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)比較見下圖所示：
圖３ 不同表達(dá)系統(tǒng)比較
ＶＬＰｓ疫苗的純化與組裝
病毒樣顆粒的純化主要包括４個(gè)步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制［４］。
１、裂解：當(dāng)宿主表達(dá)的組裝ＶＬＰｓ無法分泌至胞外時(shí)，純化時(shí)需要先對細(xì)胞進(jìn)行裂解［５］，哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞一般采用去污劑處理，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法［６－７］則多用于細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞。裂解過程中最重要的是防止蛋白降解，因此需要根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇合適的緩沖體系，并添加蛋白酶抑制劑和蛋白穩(wěn)定劑［８］。
２、粗提：這一步是將細(xì)胞碎片和大聚合物去掉［９］。離心是蛋白粗提過程中常用的方法，一般使用低速離心機(jī)或者連續(xù)流離心機(jī)［５］。
３、濃縮：這一步主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析、疏水層析及親和層析等［１０］。
４、精純：精制的主要目的是去除宿主自身表達(dá)的蛋白質(zhì)和ＤＮＡ，同時(shí)去除工藝過程引入的雜質(zhì)。精純主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。
５、組裝：由于不完全或者不規(guī)則的組裝會導(dǎo)致ＶＬＰｓ疫苗效果的下降，因此，有時(shí)需要對ＶＬＰｓ進(jìn)行去組裝和重組裝處理，以提高ＶＬＰｓ的穩(wěn)定性、均一性和免疫原性［１１］。而且需要根據(jù)ＶＬＰｓ自身性質(zhì)選擇合適緩沖體系，例如ＨＰＶ１６Ｌ１ ＶＬＰｓ的去組裝需要在高ｐＨ、低鹽和還原劑的溶液下進(jìn)行，重組裝則需要在低ｐＨ、高鹽和去還原劑的條件下進(jìn)行［９］。
病毒樣顆粒的鑒定
在制備ＶＬＰｓ的過程中，要對ＶＬＰｓ的制備情況進(jìn)行檢測，主要通過以下４個(gè)方面：性質(zhì)、含量、效果和純度。
１、性質(zhì)：ＶＬＰｓ性質(zhì)的檢測主要包括ＶＬＰｓ的形態(tài)、大小、氨基酸序列、相對分子質(zhì)量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面［１２］。方法包括ＳＤＳ／ＰＡＧＥ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法、ＥＬＩＳＡ法、表面等離子體共振技術(shù)、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質(zhì)測序法、質(zhì)譜法等。
２、含量：主要的方法有ＥＬＩＳＡ法、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、紫外分光光度法等。
３、效力：證明ＶＬＰｓ疫苗效果的關(guān)鍵，主要包括體外試驗(yàn)，如血凝抑制試驗(yàn)；體內(nèi)試驗(yàn)，如免疫試驗(yàn)、攻毒試驗(yàn)等。
４、純度：檢測純化和精制效果的關(guān)鍵，同時(shí)也與能否用于臨床試驗(yàn)相關(guān)。純度檢測主要檢測ＶＬＰｓ結(jié)構(gòu)蛋白的純度、ＶＬＰｓ的組裝率、宿主ＤＮＡ和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ＥＬＩＳＡ法、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ法、ＤＮＡ染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗(yàn)、透射電鏡檢測法等［８］。
ＶＬＰｓ疫苗的未來
ＶＬＰｓ疫苗，作為一種無活性、高效率的疫苗制備方式，正在改變我們對未來免疫防御的認(rèn)知。同時(shí)由于其對目標(biāo)宿主細(xì)胞的天然親和力特性已被用于如基因治療、靶向給藥等細(xì)胞靶向應(yīng)用，也可與探針結(jié)合應(yīng)用于生物成像或揭示病毒感染機(jī)制等基礎(chǔ)研究當(dāng)中，ＶＬＰｓ代表著免疫科學(xué)的前端進(jìn)展，提供了一種強(qiáng)大且安全的工具為人類健康做貢獻(xiàn)。
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