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表觀遺傳修飾在多種生物和病理過程中起著關(guān)鍵作用，其中５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的早期分子事件，并已成為一個非常有前景的生物標(biāo)志物。近年來，５－羥甲基胞嘧啶（５ｈｍＣ）作為５ｍＣ的氧化產(chǎn)物，在正常哺乳動物生長和發(fā)育中也扮演著重要角色，并與癌癥和神經(jīng)疾病等疾病相關(guān)，顯示出作為癌癥診斷理想生物標(biāo)志物的巨大潛力。然而，由于５ｈｍＣ水平比５ｍＣ低約１４倍，且其結(jié)構(gòu)與Ｃ和５ｍＣ相似，使得５ｈｍＣ的定量檢測更具挑戰(zhàn)性。
近日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院彭小煥博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ》期刊發(fā)表題為＂Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ＂的科研成果，研究建立了一種名為ＥＤＤ－５ｈｍＣ的５ｈｍＣ定量方法，該方法通過結(jié)合酶切（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）和生物脫氨（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）策略，利用ｑＰＣＲ平臺實(shí)現(xiàn)對片段特異性ＤＮＡ序列中５ｈｍＣ的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了５ｈｍＣ水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，結(jié)果顯示單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的ＲＯＣ曲線下面積高達(dá)８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的ＲＯＣ曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量５ｈｍＣ水平的方法。
標(biāo)題：Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ（通過結(jié)合酶切和脫氨作用的ｑＰＣＲ對５ｈｍＣ片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）
期刊：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
日期：２０２５－１－１３
技術(shù)平臺：擴(kuò)增子ＡＰＯＢＥＣ偶聯(lián)ＤＮＡ羥甲基化測序（ＡＣＥ－ｓｅｑ）、ｑＰＣＲ等
準(zhǔn)確鑒定和定量５ｈｍＣ有助于闡明其在基因表達(dá)和疾病發(fā)病機(jī)制中的功能，目前的５ｈｍＣ分析方法在臨床應(yīng)用中，存在假陽性結(jié)果的風(fēng)險以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性ＤＮＡ序列的５ｈｍＣ定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性－－ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的５ｈｍＣ，然后利用ＡＰＯＢＥＣ（載脂蛋白Ｂ ｍＲＮＡ編輯催化多肽樣）介導(dǎo)的脫氨基作用，有效區(qū)分各種胞嘧啶（Ｃ）修飾狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了極高特異性的５ｈｍＣ定量，使非特異性擴(kuò)增減少８Ｍ倍。此外，ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的非破壞性生物處理過程表現(xiàn)出高靈敏度，最低檢出限（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬＯＤ）達(dá)到３０ ａＭ。研究人員利用該方法首次檢測了結(jié)直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的５ｈｍＣ水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的受試者工作特征曲線下面積高達(dá)８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量５ｈｍＣ水平的方法。
研究摘要
研究方法
研究中基于ＡＣＥ－ｓｅｑ分析提出的ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法包括四個步驟：
（１）通過Ｔ４－β－葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（Ｔ４ ＢＧＴ）和尿苷二磷酸葡萄糖（ＵＤＰ－葡萄糖）反應(yīng)，對５ｈｍＣ進(jìn)行高效無損傷的葡萄糖基化，生成５ｇｈｍＣ；
（２）應(yīng)用葡萄糖基－５－羥甲基胞嘧啶敏感的限制性內(nèi)切酶（ＧＳＲＥｓ）消化Ｃ和５ｍＣ，富集完整的５ｇｈｍＣ目標(biāo)；
（３）通過ＡＰＯＢＥＣ脫氨基將Ｃ和５ｍＣ轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（Ｕ），而５ｇｈｍＣ仍被讀作Ｃ；
＊以上３步驟均為ＡＣＥ－ｓｅｑ測序的基本原理
（４）使用特異性引物和ＴａｑＭａｎ探針結(jié)合并擴(kuò)增５ｇｈｍＣ以產(chǎn)生熒光信號。該方法基于ｑＰＣＲ平臺，通過酶切和脫氨基的雙重作用，有效地區(qū)分５ｈｍＣ與Ｃ和５ｍＣ，確保了極高的特異性和靈敏度。
研究結(jié)果
特異性和靈敏度：ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法通過四組不同預(yù)處理的人工合成線性雙鏈ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）驗(yàn)證了其特異性，結(jié)果顯示該方法能夠顯著減少非特異性擴(kuò)增，將非特異性擴(kuò)增減少了超過八百萬倍，檢測限達(dá)到３０ ａＭ。
臨床樣本驗(yàn)證：使用未甲基化ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ、甲基化ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ和人腦基因組作為模型樣本，選擇了ＥＧＦＲ基因作為目標(biāo)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，只有經(jīng)過Ｔ４ ＢＧＴ－ＡＰＯＢＥＣ或Ｔ４ ＢＧＴ－ＭｓｐＩ－ＡＰＯＢＥＣ聯(lián)合處理的人腦基因組產(chǎn)生了特異性ＰＣＲ擴(kuò)增。
臨床診斷性能：對２５例結(jié)直腸癌患者和配對的癌旁組織樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Ｓｅｐｔｉｎ９基因的５ｈｍＣ水平在ＣＲＣ組織中顯著高于非腫瘤組織（Ｐ ＜ ０．０００１），表明Ｓｅｐｔｉｎ９基因的特定片段５ｈｍＣ水平有潛力作為ＣＲＣ的診斷標(biāo)志物（ＡＵＣ ＝ ０．８２８）。
ＡＣＥ－ｓｅｑ在本研究中的作用
ＡＣＥ－ｓｅｑ（ａｍｐｌｉｃｏｎ ＡＰＯＢＥＣ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）在本研究中用于確定ＨＣＴ１１６細(xì)胞中與Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２相關(guān)的５ｈｍＣ信息，以及ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)。這些信息對于選擇特定的ＤＮＡ片段進(jìn)行ＥＤＤ－５ｈｍＣ分析至關(guān)重要，確保研究中所使用的ＤＮＡ片段具有高ＤＮＡ甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（ＣＲＣ）強(qiáng)相關(guān)。通過ＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的數(shù)據(jù)為ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法的驗(yàn)證和應(yīng)用提供了準(zhǔn)確的５ｈｍＣ修飾信息，從而提高研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
重要圖形
（１）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ表征ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)
為了檢驗(yàn)ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對實(shí)際樣本的可行性，選擇三種模型樣本進(jìn)行驗(yàn)證：未甲基化的ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ（雙敲除）、甲基化的ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ和人類大腦基因組。首先選擇在人類大腦基因組中富含５ｈｍＣ的表皮生長因子受體（ＥＧＦＲ）基因作為目標(biāo)基因，對選定檢測片段的基因組進(jìn)行ＣｐＧ島預(yù)測，并通過（ａｍｐｌｉｃｏｎ ＡＰＯＢＥＣ偶聯(lián)表觀遺傳測序）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ對ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)進(jìn)行表征。測序結(jié)果顯示，ＥＧＦＲ片段（ｃｈｒ７：５５０８２６１０?５５０８２７２４，稱為ＥＧＦＲ ｇｅｎｅ ６８６３５）在人類大腦基因組中高度富集（平均４４．５６％），而在未甲基化的ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ和甲基化的ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ中含量較低（平均分別為０．１８％和０．６６％）。
圖１：用于ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測的候選ＥＧＦＲ位點(diǎn)。
（２）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定ＨＣＴ１１６細(xì)胞中目標(biāo)位點(diǎn)對應(yīng)的５ｈｍＣ信息
通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定了ＨＣＴ１１６細(xì)胞中位點(diǎn)對應(yīng)的５ｈｍＣ信息，最終選定的序列片段為ｃｈｒ１７：７７３７３３４２?７７３７３４３７、ｃｈｒ８：９６４９４０９３?９６４９４２１５和ｃｈｒ８：９６４９４０３９?９６４９４１１１，分別命名為Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９，這些片段位于研究團(tuán)隊(duì)先前研究中鑒定的高ＤＮＡ甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（ＣＲＣ）強(qiáng)相關(guān)。
圖２：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法中使用的Ｓｅｐｔｉｎ９（Ａ）、ＳＤＣ２ ３１３（Ｂ）和ＳＤＣ２ ２３９（Ｃ）的最終選定位點(diǎn)。
（３）ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能和臨床診斷性能
為了評估ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的靈敏度，通過２倍系列稀釋ＨＣＴ１１６基因組ＤＮＡ來評估已建立檢測法的分析性能，其中羥甲基化ＤＮＡ的理論ｉｎｐｕｔ拷貝數(shù)通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的５ｈｍＣ比例計(jì)算得出。分析結(jié)果表明，對于Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９，隨著羥甲基化ＤＮＡ濃度降低，Ｃｔ值逐漸增加。羥甲基化拷貝數(shù)與Ｃｔ值之間的關(guān)系分別為Ｒ2＝０．９９、Ｒ2＝０．９９和Ｒ2＝０．９５，這突出了ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的定量分析能力。
使用含有１０、１０和３０個拷貝／反應(yīng)的Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９羥甲基化ＤＮＡ的樣本，進(jìn)行了２０次重復(fù)檢測，以研究已建立檢測法的ＬｏＤ。結(jié)果表明在２０次重復(fù)反應(yīng)中，Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９呈陽性的概率分別為９５％、１００％和１００％，表明Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９的檢測靈敏度分別約為１０、１０和３０個拷貝／反應(yīng)，得出的ＬｏＤ約為３０ ａＭ，高于先前報(bào)道１１３．７ ａＭ靈敏度的５ｈｍＣ檢測方法。因此，本研究建立優(yōu)化后的ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法表現(xiàn)出高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
圖４：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能。
易小結(jié)
ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的建立，能夠在ｑＰＣＲ平臺上以極高的特異性和高靈敏度準(zhǔn)確定量特定片段的５ｈｍＣ水平。該方法顯著減少了假陽性信號，提高了檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)了約３０ ａＭ的最低檢出限（ＬｏＤ）。同時，該方法首次證明了檢測單個基因Ｓｅｐｔｉｎ９中的特定５ｈｍＣ片段作為ＣＲＣ的新表觀遺傳生物標(biāo)志物的巨大潛力，其ＡＵＣ高達(dá)８２．８％。未來，通過擴(kuò)展其應(yīng)用到其他疾病和研究更多標(biāo)志物，ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法可能為與５ｈｍＣ水平差異相關(guān)的疾病提供有效的臨床檢測和驗(yàn)證研究的新工具。
參考文獻(xiàn)：
Ｐｅｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２０２５ Ｊａｎ １３． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．４ｃ０５１４７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３９８０４２１４．
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